细胞培养cell culture

在模拟机体内的生理环境中，维持细胞生长、繁殖的技术。培养的材料是组织则称组织培养； 培养材料是器官原基、器官的一部分或整个器官，并保持器官原有的结构和功能则称器官培养。一般将细胞培养称无结构性生长，器官培养称结构性生长。
细胞培养是一项程序复杂、工作环节多、要求条件严格的实验性工作，它需要熟练的操作技术，需要制订统一的标准化工作方法，并严格执行，使培养条件在一定时间内保持稳定。
器皿的清洗非常重要，经培养后的各种残留物，如细胞碎屑、代谢产物、蛋白质及其降解产物等都可能对细胞产生毒害，造成培养工作的失败。因此对所有器皿、器械、滤器及胶塞等均需按不同要求分别严格清洗。
防止污染是培养工作的首要条件，必须对经过严格清洗、严密包装的器皿或用具进行严格灭菌以达到无菌。
动植物细胞均需在适宜的温度范围内，才能正常生长繁殖，如哺乳动物细胞一般要求在37～37.5℃；鸡胚细胞38℃; 两栖类细胞25℃; 温水鱼25～30℃; 冷水鱼20℃，果蝇和蚊22～25℃。
细胞在体外生长过程中，必须维持环境pH值的相对衡定，无论是平衡盐溶液、培养基，还是消化用液都必须调至细胞生长的最适pH，如哺乳动物最适pH为7.2～7.4，蛙7.5，鱼7～8，鳞翅目昆虫细胞6.6～6.8之间。用二氧化碳培养箱培养可将培养物置于5%左右的CO2环境中，有利于培养用液pH的稳定。
细胞培养用液 包括平衡盐溶液(BSS)、天然培养基、合成培养基、消化液、pH调整液、抗生素液、细菌培养基和肝素抗凝剂等。配制培养用液的蒸馏水常用经两次蒸馏的再蒸馏水。
平衡盐溶液 用于洗涤细胞和配制各种细胞培养用液。主要成分为无机盐，有时加葡萄糖。无机盐不几种常用平衡盐溶液(g/l)仅是细胞进行生命活动所必需，且在维持渗透压、缓冲性和调节溶液的酸碱度方面也起重要作用； 葡萄糖作为细胞代谢所需能量来源。各种平衡盐溶液的成分差别不大，主要区别在于缓冲系统（见表）。Earle's BSS液及Hanks液最为常用，后者缓冲能力较弱，须用NaHCO₃调节pH; Earle液含较高浓度的NaHCO₃，缓冲能力较强，须用5%二氧化碳平衡。配制消化液和特殊用途的洗涤液时则宜选用钙、镁离于含量较低的Dulbecco液和无钙、镁离子的D-Hanks液。平衡液中常加入少量酚红作为指示剂，以便观察培养液的pH变化。

成分 名称	Ringer	Tyrode	Earle	Hanks	Dulbecco	D-Hanks
NaCl KCl CaCl2 MgCl2·6H2O	9.00 0.42 0.25	8.00 0.20 0.20 0.10	6.80 0.40 0.20	8.00 0.40 0.14	8.00 0.20 0.10 0.10	8.00 0.40
MgSO4·7H2O			0.20	0.20
Na2HPO4·H2O				0.06	1.42	0.06
Na2HPO4·2H2O		0.05	0.14		0.02
KH2PO4				0.06		0.06
NaHCO3 葡萄糖		1.00 1.00	2.20 1.00	0.35 1.00		0.35
酚 红			0.02	0.02	0.02	0.02

引自鄂征：《细胞培养技术》，第56页。

天然培养基 包括血浆、鼠尾胶原、体液、淋巴液、胚胎或组织浸出液、血清等。血浆中最常用的是鸡血浆，它具有一定的营养，与少量鸡胚浸出液混合后可以很好地凝固，有利于支持细胞的生长。血清种类很多，以胎牛血清最理想。目前多采用小牛血清，其中含有丰富的营养物质，可供动物细胞生长繁殖之需，且能中和某些有毒物质的毒性，是细胞培养工作中使用量最大的一种。血清代用品有聚乙烯吡咯烷酮、蛋白胨、水解乳蛋白等。有人将水解乳蛋白制备成简单培养液与合成培养液混用，以节省血清用量。
合成培养基 用多种氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖和其他生长因子配制而成，如摩根(Morgan)设计的199培养基含60多种成分。在这些成分中，氨基酸是维持氮平衡和合成蛋白质的基本物质，其中13种氨基酸是必需氨基酸，另外还适当加入一些非必需氨基酸。由于细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，如缺乏将导致细胞生长不良甚至死亡，故培养液中一般含较大量的谷氨酰胺。维生素是维持细胞生长所必需的一种活性物质，在细胞内大多形成酶的辅基或辅酶，如缺乏将对细胞代谢产生重大影响。葡萄糖是细胞生命活动的能量来源，也是合成蛋白质和核酸所需要的重要原料。有时在培养液中还加入其他糖类物质，如核糖，脱氧核糖等。无机盐是参与细胞代谢活动及构成细胞组成部分的重要物质，为保持细胞生长繁殖所必需，它们必需包括平衡盐溶液中的成分以及Fe2+、Zn2+、Cu²⁺等一些微量元素离子。
各种合成培养基虽然都由上述几类物质组成，但在配方上千差万别，它们都是为适应细胞培养的不同要求而设计的，如Earle基础培养基BME含13种L-氨基酸、9种维生素以及无机盐和血清等，用于鼠及人细胞的培养；后加入高浓度的必需氨基酸而成MEM，可维持较长时间不换液； 以后在MEM基础上增加维生素、氨基酸和非必需氨基酸及硝酸铁以专用于培养仓鼠细胞增殖多瘤病毒。RPMI1640最初是针对淋巴细胞而设计的一种培养基。而CMRL培养基能在无血清条件下维持细胞的生长。
在合成培养基中常加入胎牛血清或新生小牛血清，主要是利用其中含有的血清白蛋白及α-球蛋白两种成分，前者能刺激细胞的生长； 后者能促进细胞贴壁伸展及拮抗胰蛋白酶活力、保证经胰蛋白酶消化后的细胞正常生长。血清在使用前必须经检测，确保没有杂菌或枝原体污染。有的血清对细胞有毒性，可进行细胞毒性试验以丢弃有毒性的血清，或将数头牛的血清混用以中和毒性。又由于血清成分复杂，会影响一些实验中的分析，而人们正在积极探索不需血清的无血清培养基。
消化液 用于分离、分散组织及细胞。可分酶消化和非酶消化两种： 酶消化液常用胰蛋白酶，其作用是催化精氨酸或赖氨酸的羧基及其他氨基酸的氨基间肽的水解， 使细胞分散。 其他如链霉蛋白酶、 胶原酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶等亦可用于消化。非酶消化主要用EDTA溶液，这是一种化学螯合剂，对细胞有一定解离作用，毒性小，使用方便。其他非酶法如玻璃柱吸附分离B细胞组分，利用专一性化合物进行细胞的分层分离，如用尼龙纤维分离淋巴细胞等。
方法 细胞培养根据组织种类、培养目的及条件不同而异。
原代培养与传代培养 从机体取出细胞、组织或器官，进行体外培养，在初次传代之前称原代培养。原代培养的细胞生长到一定密度后，从原瓶取下，分装入一个以上的培养瓶中后称传代培养。
贴壁培养与悬浮培养 接种后的细胞固着于瓶壁增殖称贴壁培养，接种后的细胞悬浮在培养基中生长增殖称悬浮培养。大多数细胞适合于用贴壁培养，但有些细胞适合于用悬浮培养，如长期培养的淋巴细胞，较多种的昆虫细胞等。
转鼓培养 把细胞接种入中性硬质试管中，试管插入恒温箱内的转鼓上，每分钟转动10～20转，使细胞交替地接触培养基和空气，此法十分有利于细胞的生长。
连体细胞培养 两种细胞培养于相互连接的两个培养管中，以研究细胞间的相互作用的方法。其装置是两个特殊的短试管，用一分支管或其他结构将它们连接起来，中间隔以微孔薄膜，培养液可由一管进入另一管，两试管分别接种两种细胞，进行静止培养或旋转培养。通过观察或细胞计数可以了解细胞间的相互作用。有的细胞在体外生长相当困难，为建立这种细胞的细胞系，常在这一装置的一个管中接种生长良好的同物种细胞作为饲养细胞，另一管中接种需要培养的细胞，饲养细胞所产生的物质有助于另一种细胞的生长，从而达到培养另一种细胞的目的。
微载体培养 在贴壁培养时加入适宜的固体粒子，使之悬浮在培养基中，贴壁细胞能借这些微粒表面生长，使培养物不仅具有贴壁培养的特点，能用于原代培养及二倍体细胞的培养； 又有悬浮培养的特点，使之较贴壁培养更能控制温度、pH、CO2及O2等因素，而且由于大大扩大了表面积而可大量繁殖细胞。故此法有较多的优越性，所用固体微粒须有适宜的直径、无毒、易被细胞所贴附，以DEAE-Sephadex A50较为理想。
应用 20世纪下半叶，随着分子生物学崛起，细胞培养已被广泛应用于与生物科学有关的各个领域。在基因工程和细胞工程研究中，真核细胞的基因转移、染色体导入、细胞融合、细胞拆合、杂交瘤和单克隆抗体技术，以至基因疫苗的生产都将细胞培养作为基本实验途径； 在细胞生物学，体外观察到了细胞的生长、繁殖、分裂、分化和运动、吞噬等过程，以及正常和肿瘤细胞的各种差别，大大增加了人类对生命本质的认识； 在病毒学领域，各种细胞系以及各种条件下的培养细胞为病毒学研究提供了丰富的实验材料。细胞培养是病毒的分离、抗原制备，病毒特性的了解和鉴定的重要途径； 在医学遗传学，细胞培养为某些遗传性疾病的诊断和治疗，胎儿产前健康诊断提供了有效途径； 在环境科学，利用细胞培养可以研究环境化学污染对人畜的影响，以及放射性污染对生物体的损伤。近年来，植物的组织培养取得了飞速进展，使植物的育种工作以及人类对生物体的认识提高到了一个全新的高度。